Principali linee di ricerca:
THEC si concentra sulla chemogenomica e biologia del cancro, in particolare delle neoplasie ematologiche. I progetti di ricerca hanno implicazioni traslazionali e vedono la collaborazione dell’Ematologia dell’A.O.U. Parma. In particolare, a screening di “small molecules” vengono associati approcci genetici (sh/sgRNA, CRISPR/Cas9), di biologia cellulare e di genomica (RNAseq, ChIP-seq, NGS) al fine di identificare nuovi target e strategie terapeutiche. Segue una validazione in vivo su modelli murini.
La principale linea di ricerca riguarda il pathway di Notch1, fattore di trascrizione frequentemente mutato nelle T-ALL, con lo scopo di identificare nuove terapie target. Abbiamo recentemente caratterizzato un inibitore di SERCA (CAD204520), che modula indirettamente il pathway di Notch1, e riduce gli effetti off-target caratteristici di altri SERCA inibitori pur mantenendo proprietà anti-leucemiche in vitro e in modelli murini.
THEC si occupa inoltre dello studio del pathway di Notch1 su modelli di T-ALL, MCL e CLL e di altri fattori di trascrizione determinanti nelle neoplasie ematologiche. Sebbene i fattori di trascrizione rappresentino un bersaglio ideale nella terapia molecolare, sono stati spesso ignorati nello sviluppo farmacologico, in parte per la difficoltà a sviluppare high-throughput screening assays per l’identificazione di modulatori specifici e inoltre per l’inaccessibilità chimica di queste molecole. Tuttavia, l’utilizzo di library di composti chimici ha permesso l’identificazione di nuove terapie bersaglio. In relazione a quest’aspetto, il laboratorio è al centro di un progetto nazionale e regionale per l’utilizzo di una piattaforma di drug profiling con lo scopo di associare profili di sensibilità ai dati di genomica e identificare nuove terapie.
Tecniche in uso:
Le metodologie più innovative riguardano il drug profiling per l’identificazione di terapie personalizzate. Abbiamo sviluppato una piattaforma che permette il trattamento di cellule derivate da sangue midollare/periferico di pazienti con library contenenti centinaia di molecole differenti. Il processo è altamente automatizzato e permette di eseguire esperimenti in high-throughput, con riduzione al minimo dell’errore umano, estrema ripetibilità e risparmio su tempi e materiali. La velocità di esecuzione del sistema offre la possibilità di lavorare su campioni di pazienti appena prelevati e di avere un risultato traslabile in tempi brevi. THEC inoltre esegue studi di sinergia tra combinazioni di più farmaci. La validazione dell’efficacia di farmaci in vitro può essere eseguita con studi di high-throughput flow cytometry, che oltre a monitorare la risposta farmacologica in termini di vitalità cellulare, garantisce analisi immunofenotipiche e studi funzionali di target discovery. Il laboratorio inoltre utilizza tecniche innovative di genome editing (es: CRISPR-Cas9) per ricapitolare e validare il fenotipo di inibizione chimica. Infine, grazie all’accesso diretto alle strutture di sequenziamento esegue valutazioni diagnostiche di NGS in pazienti affetti da malattie ematologiche. Questo permette di aumentare la complessità dei lavori di ricerca e identificare sempre più esaustivamente i meccanismi genetici e molecolari responsabili della resistenza ai farmaci.
Principali strumenti in dotazione:
a. Tecan D300e Digital Dispenser. Utilizzando la tecnologia HP Direct Digital Dispensing, fornisce da picolitri a microlitri l'erogazione senza contatto di liquidi direttamente nella piastra di dosaggio, risparmiando tempo e riducendo al minimo il consumo di campioni. Offre un metodo semplice per generare curve dose-risposta, esperimenti di sinergia tra più farmaci, profili enzimatici e impostazione di reazioni per PCR.
b. Citofluorimetro Attune NxT. Sistema di analisi compatto che permette di valutare caratteristiche citofluorimetriche assicurando dati consistenti e riproducibili anche su campioni difficili e/o popolazioni poco rappresentate. La configurazione attuale dello strumento prevede un laser Blue (488 nm) per letture fino a 4 colori. Lo strumento è dotato inoltre di un auto-sampler con capacità di lettura di piastre (96 e/o 384-well) in high-throughput, garantendo acquisizioni veloci e ripetibili su grandi quantità di campioni.
c. Integra Assist Plus. Strumento in grado di eseguire metodiche differenti di pipettatura con altissima precisione e velocità, garantendo una riduzione dell’errore operatore-dipendente, alta riproducibilità e velocizzando il lavoro su esperimenti in high-throughput. Sono possibili differenti configurazioni per piastre, reservoir, alloggi per provette.
d. Multidrop Combi Reagent Dispenser. Dispensatore di fluidi per differenti tipologie di piastre con possibilità di settaggio di un ampio range di volumi (da 0,5 fino a 2500 microlitri). Garantisce una riduzione del volume morto e dell’utilizzo/spreco di reagenti, velocità di esecuzione e riduzione dell’errore umano.
e. Stabulario. La struttura è disponibile presso il campus universitario. È organizzato in modo da permettere la manipolazione e l’idoneo mantenimento degli animali, rispettando le loro necessità. Le stanze sono adibite in modo da offrire un ambiente che tenga conto delle esigenze fisiologiche ed etologiche della specie ospitata e in tutti i locali sono presenti condizioni controllate di illuminazione, temperatura e umidità dell’ambiente. Lo stabulario è inoltre fornito di un ambiente idoneo al mantenimento di topi immunocompromessi, dotato di armadi stabulari termostatati e con filtri opportuni per la purificazione dell’aria. L’utilizzo dello stabulario garantisce la validazione degli studi e dei modelli in vitro al fine di permettere una più rapida traslazione clinica.
f. MinION Nanopore Oxford Technology. Il sequenziamento dei nanopori è una tecnologia che consente l'analisi diretta e in tempo reale di lunghi frammenti di DNA o RNA. Funziona monitorando le modifiche a una corrente elettrica mentre gli acidi nucleici passano attraverso un nanoporo proteico. Il segnale risultante viene decodificato per fornire la sequenza specifica di DNA o RNA. Uno dei principali vantaggi del sequenziamento dei nanopori è la capacità di produrre ultra-long reads di DNA e sono state raggiunte lunghezze di lettura superiori a 2 Mb.
g. Perkin Elmer Victor X4 Multiple Plate Reader. Offre tecnologie di luminescenza, intensità di fluorescenza, assorbanza UV (UV-VIS) e fluorescenza time-resolved, utile per saggi biochimici e metabolici.
h. Odyssey Infrared Imaging System. È un sistema di acquisizione e visualizzazione digitale di bande proteiche dotato di alta sensibilità. Permette di condurre rapidamente analisi di dati in maniera accurata e con alta riproducibilità, evitando i rischi di saturazione dell'immagine rispetto alle più tradizionali tecniche di rilevazione ECL. Sfrutta la tecnologia Multiplex con due colori fluorescenti: il principale vantaggio dell'uso di anticorpi secondari marcati con fluorescenza è la capacità di rilevare bersagli multipli utilizzando fluorofori con spettri di eccitazione ed emissione non sovrapposti.
i. EVOS FL fluorescence microscope. Il sistema di imaging EVOS incorpora fotocamere ad alta risoluzione, sorgenti luminose a LED luminose. È completamente automatizzato ed è dotato di strumenti di imaging avanzati per gestire filmati time-lapse, scansione di piastre, affiancamento di immagini e conteggio delle cellule.
